Cykl kwasu cytrynowego, cykl kwasów trikarboksylowych (TCA) lub cykl Krebsa – cykliczny szereg reakcji biochemicznych . Stanowi końcowy etap metabolizmu aerobów , czyli organizmów oddychających tlenem . Mechanizm cyklu zbadał w latach 30. XX wieku sir Hans Krebs , a kluczowe elementy cyklu przedstawił w 1937 , za co został nagrodzony w 1953 Nagrodą Nobla .

Cykl kwasu cytrynowego przebiega w macierzy (matrix) mitochondrialnej eukariontów i w cytoplazmie prokariontów . Substratem cyklu jest acetylokoenzym A (acetylo-CoA, czynny octan), który po połączeniu ze szczawiooctanem daje cytrynian ( koenzym A odłącza się), a następnie w wyniku kolejnych reakcji izomeryzacji , dehydrogenacji , hydratacji , dehydratacji i dekarboksylacji zostaje utleniony do dwóch cząsteczek dwutlenku węgla . Jednocześnie regeneruje się cząsteczka szczawiooctanu. W wyniku utleniania z jednej reszty octanu redukują się 3 cząsteczki NAD i jedna FAD , powstaje też cząsteczka guanozynotrifosforanu ( GTP , równoważnik ATP ), sumarycznie daje to 12 cząsteczek ATP zysku z jednej cząsteczki Acetylo-CoA .

Przebieg

Substraty

Głównym substratem cyklu kwasu cytrynowego jest acetylo-CoA (CoASAc). Może on pochodzić z różnych źródeł. Zwykle powstaje z pirogronianu (produktu glikolizy ) w reakcji katalizowanej przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej w mitochondrium . Stanowi także produkt β-oksydacji kwasów tłuszczowych .

Drugim substratem pierwszej reakcji cyklu jest szczawiooctan , odnawiany przez sam cykl, w razie niedoboru wytwarzany także dzięki reakcjom anaplerotycznym. Jego powstawanie z pirogronianu stymuluje sam acetylo-CoA, pobudzając karboksylazę pirogronianową. Związek ten może powstać także na drodze transaminacji z odpowiedniego aminokwasu : kwasu asparaginowego .

Cykl kwasu cytrynowego

Synteza cytrynianu

ΔG'°=-31.4 kJ/mol

Budowa syntazy cytrynianowej^[1].

W pierwszej reakcji cyklu acetylo-CoA łączy się ze szczawiooctanem w reakcji katalizowanej przez syntazę cytrynianową. W efekcie tworzy się cytrynylo-CoA, który rozpada się na wolny koenzym A (CoASH) i cytrynian . Należy zwrócić uwagę, że ten ostatni jest związkiem sześciowęglowym.

Inhibitorami tego etapu są ATP (gdyż jego obecność świadczy o mniejszym zapotrzebowaniu energetycznym komórki) oraz acyli-CoA o długich łańcuchach alifatycznych (są to reszty kwasów tłuszczowych).

Izomeryzacja

ΔG'°=+6.3 kJ/mol

Budowa akonitazy^[2]

Cytrynian powstały w poprzedniej reakcji zazwyczaj nie jest przekazywany do środowiska wodnego macierzy mitochondrialnej , ale przechodzi od razu do kolejnego enzymu: akonitazy, czyli hydratazy akonitanowej. Zjawisko to zwane jest chanellingiem. Zwiększa to znacznie szybkość reakcji, bowiem enzym nie musi czekać, aż substrat się na niego "natknie", ale rozpoczyna katalizę swej reakcji natychmiast po zakończeniu poprzedniej. Poza tym dzięki temu dwie identyczne grupy -CH₂COO^- są rozróżniane przez enzym: reakcji zawsze będzie ulegała ta pochodząca od szczawiooctanu. Jeśli zaś akonitaza jest wysycona, cytrynian przechodzi do cytoplazmy, gdzie rozpada się do substratów, z których powstał. Dzięki temu nadmiar acetylo-CoA może zostać użyty do przebiegającej tam syntezy kwasów tłuszczowych.

Akonitaza przeprowadza wpierw odłączenie cząsteczki wody od cytrynianu, tworząc wiązanie podwójne. Powstaje cis-akonitan. Metabolit ten przyłącza zaś ponownie cząsteczkę wody, ale tym razem grupą hydroksylową zostaje podstawiony 2., a nie 3. atom C. Powstałą sól hydroksykwasu nazywamy izocytrynianem .W probówce reakcja izomeryzacji przebiegałaby w odwrotną stronę, wobec czego in vivo zachodzić musi nieustanne dostarczanie substratu i usuwanie produktu, co wymusza prawidłowy przebieg.

Etap ten blokowany jest przez fluorocytrynian, który może być produktem syntazy cytrynianowej, jeśli zamiast reszty acetylowej do szczawiooctanu dołączy ona fluoroacetylową.

Pierwsze utlenienie

ΔG'°=-8.4 kJ/mol

Budowa dehydrogenazy izocytrynianowej u Escherichia coli ^[3].

Izocytrynian zostaje utleniony przy użyciu NAD ⁺ przez dehydrogenazę izocytrynianową. Grupa hydroksylowa zostaje przekształcona w karbonylową. W ten sposób powstaje szczawiobursztynian. Związek ten, będąc β-ketokwasem (licząc od "środkowej" grupy karboksylowej), ulega dekarboksylacji, zanim jeszcze odłączy się od enzymu. Produkty tej reakcji to dwutlenek węgla oraz α-ketoglutaran . W przeciwieństwie do poprzednich związek ten posiada 5 atomów C.

Oksydacyjna dekarboksylacja

ΔG'°=-30.1 kJ/mol

Kompleks dehydrogenazy α-ketoglutaranowej u Escherichia coli ^[4]

Α-ketoglutaran ulega oksydacyjnej dekarboksylacji analogicznej do podobnego procesu, w którym substratem jest pirogronian. Tym razem proces katalizuje kompleks dehydrogenazy α-ketoglutaranowej. Utlenianie i dekarboksylacja także przebiega analogicznie. Wymaga ona następujących kofaktorów:

• pirofosforan tiaminy , TPP (aktywna postać witaminy z grupy B), na który przeniesieniu ulega substrat, by odłączyć CO₂
• liponamid (amid kwasu liponowego) – przenosi z TPP zdekarboksylowaną resztę pochodzącą od ketoglutaranu, redukując się
• koenzym A – odbiera tą resztę liponamidowi, w wyniku czego powstaje bursztynylo-CoA, zwany także sukcynylo-CoA
• dinukleotyd flawinoadeninowy , FAD – utlenia zredukowany liponamid, przekształcając się w FADH₂
• dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy , NAD⁺ – utlenia z kolei zredukowany FADH₂, przechodząc w NADH

NADH wędruje oddać równoważniki redukcyjne na łańcuch oddechowy.

Produkt, bursztynylo-CoA, posiada resztę posiadającą już tylko 4 węgle.

Fosforylacja substratowa

ΔG°′ = -3.3 kJ mol^-1

Budowa syntetazy bursztynylo-CoA u Sus scrofa ^[5]

Bursztynylo-CoA, posiadając wiązanie wysokoenergetyczne, zostaje wykorzystany do przeprowadzenia fosforylacji substratowej przy użyciu fosforanu nieorganicznego. Katalizujący ten proces enzym nazywany jest syntetazą sukcynylo-CoA albo tiokinazą bursztynianową. W większości tkanek związkiem, na który przenosi się energia , jest ADP (adenozynodifosforan). Jednakże w komórkach przeprowadzających proces glukoneogenezy i w związku z tym potrzebujących GTP (wykorzystywanego przez karboksykinazę fosfoenolopirogronianową) występuje także drugi izoenzym – fosforylujący GDP . Wiąże się z tym pewien rodzaj regulacji glukoneogenezy. Mianowicie odnawianie puli glukozy ma sens tylko, kiedy ładunek energetyczny jest dość duży. Jeśli cykl Krebsa dostarczałby zbyt mało energii, produkowałby więc też mało GTP i ograniczałby glukoneogenezę.
W reakcji oprócz trójfosforanu puryny powstają wolny koenzym A i bursztynian . Ponieważ cząsteczka tego ostatniego jest symetryczna i oba jej końce nie różnią się między sobą, od tego momentu nie możemy już odróżnić, który atom węgla pochodził z wprowadzonej do cyklu reszty acetylowej, a który ze szczawiooctanu.

Utlenienie bursztynianu

ΔG'°=0 kJ/mol

Budowa dehydrogenazy bursztynianowej u Escherichia coli ^[6].

Bursztynian ulega odwodornieniu katalizowanemu przez dehydrogenazę bursztynianową . Przenosi ona równoważniki redukcyjne z bursztynianiu na dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), tworząc fumaran oraz FADH₂. Nadmienić należy, że w przeciwieństwie do innych enzymów cyklu Krebsa dehydrogenaza ta jest trwale związana z wewnętrzną błoną mitochondrium, stanowi bowiem 2. kompleks przenośników elektronów łańcucha oddechowego.

Przyłączenie cząsteczki wody

ΔG'°=-3.8 kJ/mol

Budowa fumarazy u Saccharomyces cerevisiae ^[7].

Fumaran posiada wiązanie podwójne węgiel-węgiel w konfiguracji trans , do którego przyłącza się cząsteczka wody. Reakcję tą katalizuje fumaraza nazywana także hydratazą fumaranową. W rezultacie powstaje L- jabłczan . Ponieważ oba końce cząsteczki fumaranu są nieodróżnialne, grupa hydroksylowa jabłczanu może znajdować się zarówno przy atomie węgla pochodzącym ze szczawiooctanu, jak i przy dostarczonym przez acetylo-CoA.

Odtworzenie szczawiooctanu

ΔG'°=+29.7 kJ/mol

Budowa dehydrogenazy jabłczanowej u Thermus flavus^[8].

L- jabłczan ulega w ostatniej reakcji cyklu utlenieniu z odtworzenie szczawiooctanu, który może przyłączyć kolejną resztę acetylową. Proces ten katalizuje dehydrogenaza jabłczanowa, enzym przenoszący równoważniki redukcyjne na dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy NAD⁺, tworząc jego zredukowaną formę NADH.

Substratem dla tego specyficznego biokatalizatora jest jedynie występujący w naturze izomer L jabłczanu. Otrzymany sztucznie enancjomer D nie jest rozpoznawany przez białko.

Regulacja cyklu kwasu cytrynowego

Cykl kwasy komórkowego jako ważny szlak metaboliczny umożliwiający zarówno utlenianie związków organicznych, jak i syntezę wielu substratów do biosyntez musi podlegać ścisłej kontroli. Regulacja zachodzenia cyklu odbywa się w kilku punktach. Krytycznym punktem w decydującym o dostarczeniu substratu do cyklu jest kompleks dehydrogenazy. Regulacji podlega kilka z enzymów kompleksu. Dehydrogenaza pirogronianowa jest hamowana w wyniku fosforylacji przez specyficzną kinazę, w sytuacji gdy zwiększa się w komórce stosunek NADH/NAD⁺, acetylo-CoA/CoA lub ATP/ADP. Obniżenie stosunków związków dostarczających energię komórce prowadzi do defosforylacji dehydrogenazy pirogronianowej przez specyficzną fosfatazę. Fosforylacja hamuje również aktywność rdzenia kompleksu – acetylotransferazy. Trzeci element o regulowanej aktywności – dehydrogenaza dihydroliponianowa jest hamowana przez NADH.

Enzymem stanowiącym punkt kontrolny w samym cyklu jest dehydrogenaza izocytrynianowa stymulowana allosterycznie przez ADP. Aktywność enzymu wzrasta również pod wpływem NAD⁺ oraz jonów Mg²⁺. Wzrost poziomu NADH prowadzi do zahamowania aktywności enzymu. Drugim enzymem cyklu stanowiącym punkt kontrolny jest dehydrogenaza α-ketoglataranowa. Jej aktywność ulega zahamowaniu, gdy wzrasta stężenie produktów katalizowanej reakcji – bursztynylo-CoA i NADH. Enzym jest hamowany także w sytuacji wysokiego poziomu ATP w komórce.

W komórkach prokariotycznych miejscem regulacji jest dodatkowo syntaza cytrynianowa hamowana allosterycznie przez ATP.

Zobacz też

• Cykl ornitynowy – zwany też mocznikowym cyklem Krebsa oraz cyklem mocznikowym.

Przypisy

Bibliografia

• Robert K Murray, Daryl K Granner, Victor William Rodwell, Franciszek Kokot, Zenon Aleksandrowicz: Biochemia Harpera ilustrowana. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2008. . 

Linki zewnętrzne

• Cykl kwasu cytrynowego (j. angielski)
• Cykl kwasu cytrynowego (j. angielski)