Zasada sekwencjonowania DNA metodą Sangera:
A. – przykładowa sekwencja DNA
B. – przyłączenie startowego
oligonukleotydu
do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA
C. – produkty syntezy DNA, zakończone
fluorescencyjnie
znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)
D. – Chromatogram rozdziału fragmentów w
elektroforezie kapilarnej
.
Sekwencjonowanie DNA – technika odczytywania
sekwencji
, czyli kolejności
par nukleotydowych
w cząsteczce
DNA
.
Sekwencjonowanie dokonuje się przy pomocy zautomatyzowanych sekwencjonatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów, lub podczas ćwiczeń[].
- Przykład sekwencji DNA (początek operonu laktozowege
E. coli
z
GenBank
):
GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG
- gdzie: A –
adenina
; C –
cytozyna
; G –
guanina
; T –
tymina
Metody historyczne
Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w
1981
[1]- r
metoda Sangera
, oparta o syntezę DNA przez
polimerazę DNA
in vitro
. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym
nukleotydem
. Produkty reakcji rozdziela się
elektroforetycznie
, co powoduję ich segregację pod względem wielkości.
Metody współczesne
Obecnie metoda odczytu została zautomatyzowana dzięki wykorzystaniu znakowanych
fluorescencyjnie
trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej
kapilary
lub linii na
żelu
[].
Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli
Walter Gilbert
i Allan Maxam (
metoda Maxama-Gilberta
)[2]. Gilbert wraz z
Frederickiem Sangerem
otrzymali za to osiągnięcie
nagrodę Nobla w dziedzinie chemii
. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.
Nowoczesne masowo równoległe aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów
par zasad
na godzinę[].
Tranzystory polowe DNA
umożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do
mikromacierzy
i odczyt w czasie rzeczywistym.
Nagroda
Archon Genomics X PRIZE
w wysokości 10 mln dolarów czeka na ośrodek, który będzie w stanie zsekwencjonować 100
genomów
ludzkich w ciągu 10 dni[3]. Pierwsze sekwencjonowanie genomu człowieka zajęło wiele lat (zob.
Projekt poznania ludzkiego genomu
).
Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w
Projekcie Genograficznym
. Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in.
genetyki genealogicznej
oraz wielu rodzajów badań testujących obecność
mutacji
.
Metody rozwojowe
-
PCR
- Metodą bąbelkową + pyrosekwencjonowanie
- 454 sequencing pozwala 300 MBp na dzień w jednej maszynie
[1]
. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.
- bezpośredniego odczytu[]:
- nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. Szybkość takiego odczytu może dochodzić od 300 Bp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika[4].
- mikroskopowe
Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA
-
1953
– opracowanie modelu
podwójnej helisy
DNA przez
Jamesa Watsona
i
Francisa Cricka
-
1972
– opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację.
-
1977
– Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt. Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną
enzymatycznie
.
-
1980
– Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali nagrodę Nobla
-
1982
– utworzono
Genbank
– publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA
- Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA
-
1982
– Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy
Hitachi
.
-
1984
– badacze z MRC odczytali kompletną sekwencję
wirusa Epstein-Barr
, 170 kb.
-
1997
– zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii
Escherichia coli
.
-
2001
,
15 lutego
– Konsorcjum
HUGO
opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w
Nature
.
-
2001
,
16 lutego
– firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w
Science
.
Przypisy